La microscopie multiphotonique permet d’obtenir une imagerie d’échantillons tridimensionnels. Grâce à la génération d’harmoniques, notamment la deuxième (SHG) et la troisième (THG), l’utilisation de fluorophores n’est plus toujours indispensable. Cependant, malgré les progrès récents de cette technologie, l’imagerie de certaines structures biologiques, telles que les organoïdes, demeure encore peu explorée. Par ailleurs, la compréhension des dommages induits par l’irradiation laser, est indispensable pour définir des conditions d’acquisition garantissant une imagerie préservant l’intégrité des échantillons. Dans ce travail, le microscope à multiphotons est appliquée à des neurosphères humaines, formées de neurones et d’astrocytes in vitro afin de les visualiser dans leur intégralité. En effet, la THG met particulièrement en évidence les tissus nécrosés ainsi que les noyaux des cellules du tissu neural. Par ailleurs, un algorithme de détection et de quantification automatique des noyaux est développé. Bien que des améliorations restent nécessaires pour accroître sa fiabilité, la densité cellulaire peut être estimée. Cependant, cette technologie peut endommager les cellules. Pour cette raison, dans cette étude, des expériences sur des poumons frais de souris sont effectuées afin de mieux comprendre les différents types de dommages induits et de déterminer les paramètres d’acquisition permettant de les éviter. Les seuils de dommages sont mesurés à 1300nm et 1650nm correspondant respectivement aux minima d’absorption de la deuxième et la troisième fenêtres du proche infrarouge (NIR II, III ). Les modifications sur le photoblanchiment de l’autofluorescence du tissu pulmonaire murin sont aussi évaluées. Enfin, un approfondissement des techniques de segmentation pour des images multispectrales permet l’identification de structures biologiques.