en
Master
French

Identification rapide de rhizobia endosymbiotiques par MALDI-TOF MS

Defense date2011
Abstract

Les rhizobia sont des bactéries formant une symbiose fixatrice d'azote avec les légumineuses. Après colonisation du système racinaire par des rhizobia compatibles avec la plante hôte, il y a formation de nodules (ou nodosités), à l'intérieur desquels les rhizobia endosymbiotiques fixeront l'azote atmosphérique au bénéfice de la plante. Le développement des nodules sur les racines des plantes hôtes et l'infection des cellules végétales par les rhizobia est appelé le processus de nodulation. Les rhizobia sont importants pour l'agriculture puisqu'ils favorisent la croissance des légumineuses même en absence d'engrais azotés et contribuent ainsi à l'enrichissement des sols. Il est donc intéressant de développer une méthode rapide et efficace pour identifier leurs espèces dans le sol et dans les nodules. La technologie choisie pour ce projet est la spectrométrie de masse MALDI-TOF, complétée par des cultures sur géloses sélectives et la chromatographie liquide (FPLC). Le but du projet était de développer une méthode permettant d'identifier rapidement et efficacement les souches de rhizobia directement à partir des nodules racinaires. Après avoir testé plusieurs méthodes, la plus fiable s'est révélée être une suspension bactérienne à partir d'un nodule écrasé suivie d'un lavage à l'acide formique 25%. C'est la première fois qu'un microorganisme a pu être identifié par MALDI-TOF MS directement à partir de l'environnement, sans une ou plusieurs étapes de cultures intermédiaires, comme par exemple la croissance sur gélose. Après la mise au point d'une méthode reproductible permettant d'identifier par MALDI-TOF MS des souches de rhizobia à partir de nodules, le travail s'est poursuivi pour valider le système et évaluer ses limites. La validation a été effectuée d'une part en testant les nodules de plantes coinfectées par deux souches distinctes de rhizobia (test de compétition), et d'autre part en analysant les nodules d'une plante de soja provenant d'un champ. Cette dernière a permis de démontrer que la méthode fonctionnait même à partir de nodules environnementaux. Les résultats obtenus par MALDI-TOF MS ont été confirmés par des cultures bactériennes sur géloses. Les limites de la méthode sont apparues pendant l'étude de nodules isolés à partir des plantes coinoculées avec la souche Sinorhizobium fredii NGR234 et une souche mutante dérivée de celle-ci. En effet, les profils obtenus par MALDI-TOF MS ne pouvaient pas être distingués, les protéines absentes de la souche mutante étant d'une taille supérieure à celles utilisées pour assembler les spectres de masses. Dans les cas où les nodosités hébergeaient des bactéries de deux souches distinctes, seul le profil MALDI–TOF MS de la souche majoritaire était obtenu. Cependant la méthode est très efficace pour différencier des souches isolées à partir de nodules différents mais appartenant à la même plante (même lorsque les deux souches sont phylogénétiquement proches) ce qui est intéressant pour l'analyse des nodules environnementaux. Pour terminer, nous nous sommes concentrés sur la séparation des protéines ribosomales à l'aide de la chromatographie liquide. Les protéines ribosomales étant souvent utilisées comme marqueurs principaux pour la création de spectres propres à une espèce (superspectres), la séparation de ces protéines nous apparaissait comme primordiale.

fre
Citation (ISO format)
MARIOTTI-NESURINI, Anna. Identification rapide de rhizobia endosymbiotiques par MALDI-TOF MS. 2011.
Main files (1)
Master thesis
accessLevelRestricted
Identifiers
  • PID : unige:17795
637views
16downloads

Technical informations

Creation12/12/2011 2:56:00 PM
First validation12/12/2011 2:56:00 PM
Update time03/14/2023 5:05:44 PM
Status update03/14/2023 5:05:44 PM
Last indexation01/29/2024 7:18:47 PM
All rights reserved by Archive ouverte UNIGE and the University of GenevaunigeBlack