Les cytochromes P450 (CYP450) sont des enzymes majeures du métabolisme des médicaments. Les problèmes pharmacocinétiques, et plus particulièrement la capacité à inhiber les CYP450 sont des facteurs d’élimination des candidats lors du développement des médicaments. Des tests fluorimétriques d’inhibition de l’activité des cytochromes P450 3A4 et 2C9 ont été développés dans ce travail pour permettre l’identification des propriétés inhibitrices des composés chimiques. Les molécules testées ont été incubées à température ambiante en présence d’un mélange d’isoforme unique de CYP, de cofacteurs, de tampons, et de substrat fluorogénique. Comme la formation du produit fluorescent baisse en présence d’un inhibiteur, l’intensité de la fluorescence diminue. A partir de ces données, il est possible de calculer l’IC50 du composé. Une optimisation des conditions du test, par l’étude de la cinétique des cofacteurs et des substrats fluorogéniques a été réalisée. De plus, l’impact des composants du milieu tel que la présence de solvant organique, la composition du tampon et la source de cofacteur a également été étudié. La détermination des courbes doses réponses des inhibiteurs de référence, et du facteur Z’ a permis de valider le test. Une détermination des IC50 de composés de référence et de composés d’origine naturelle a montré une bonne corrélation avec les données de la littérature, et a permis de mettre en évidence les facultés inhibitrices des composés, ainsi que les phénomènes de compétions entres substrats.