Transport across the outer membrane and itsregulation in <i>Caulobacter crescentus</i>

Diplôme Master Transport across the outer membrane and itsregulation in <i>Caulobacter crescentus</i> eng 2025-08-11 2025-08-04 author Dahan Virginie 922159 director Costafrolaz Jordan 654723 Département de microbiologie et médecine moléculaire (MIMOL) director Viollier Patrick 0000-0002-5249-9910 706923 Département de microbiologie et médecine moléculaire (MIMOL) 61 Today, the fight against antibiotic resistant bacteria is more important than ever as they continuously adapt to our countermeasures designed to eliminate bacterial infections. New antibacterial strategies are needed to fight back resistant clinical isolates. Here we intend to help in this fight by illuminating principles of antibiotic permeation using the Gram-negative (diderm) model organism Caulobacter crescentus, a non-pathogenic alpha-proteobacterium. As an oligotrophic and environmental bacterium, it elaborates many systems to import nutrients while expelling toxic molecules and waste products with high efficiency from the environment across the outer membrane (OM), via porins or the TonB-dependent receptors (TBDRs) and antibiotic efflux pumps, respectively. C. crescentus encodes >60 TBDRs , that are differentially expressed depending on the life stage or environment and harbor a broad variety of structures. Their precise role and their regulation remain cryptic and are still under investigation, raising the question of their need in such a number and diversity in this strain. In my project, we selected several TBDRs to study and replaced their endogenous promoters by a strong constitutive promoter to ensure expression. We performed an antibiotic sensibility assay to investigate the possible substrates of these TBDRs. During our investigations, we detected an OM structural overload of proteins that led to its destabilization and trigger feedback regulatory mechanisms. This led us to explore the bacterial response to forced TBDR expression by strong promoters, as well as massive upregulation of an efflux pump and other OM saturating systems. To probe the stress response of C. crescentus, we used a reporter of expression, a regulatory small RNA named chvR and thus its own regulatory network through a two- component regulatory system: involving the ChvI response regulator and the ChvG sensory kinase. Finally, because existing literature suggests that L-alanine and glucose could be natural TBDR substrate to be use as carbon source by the cells, we wanted to confirm the specificity to one TBDRs or infirm it as many TBDRs could substrates. To explore this idea,4 we decided to assess the fitness cost of the presence of the selected subset of strains expressing TBDRs in minimal media with either glucose or L-alanine. In summary, my project characterized the spectrum of antibiotic import by some TBDRs, the stress response to high OM protein load and finally natural TBDR substrate(s). De nos jours, le combat contre les bactéries résistantes aux antibiotiques est de la plus haute importance puisqu’elles s’adaptent constamment à nos contremesures désignées pour éliminer les infections bactériennes. De nouvelles stratégies pour les contrer sont nécessaires. Ici, nous avons l’intention d’aider ce combat avec l’utilisation de l’espèce modèle Gram-négative (diderme) -protéobactérie Caulobacter crescentus. En tant que bactérie oligotrophe et environnementale, elle développe beaucoup de systèmes pour importer et exporter des molécules avec haute efficacité depuis et vers l’environnement à travers la membrane externe (ME), comme des porines, des récepteurs TonB- dépendant (TBDRs) et des avec des pompes à efflux contre des antibiotiques. C. crescentus NA1000 contient >60 TBDRs, qui sont exprimés de manière différentielle dépendant du stade de sa vie ou de son environnement et possèdent une large variété de structures. Leur rôle précis reste cryptique et est toujours sous investigation, soulevant la question de leur nécessité en tel nombre et telle diversité dans cette bactérie. Pour mon projet, nous avons sélectionné quelques TBDRs pour lesquels le promoteur endogène a été remplacé par un promoteur fort et constitutif. Nous avons effectué des expériences de sensibilité aux antibiotiques dans le but de déterminer les substrats possibles de ces TBDRs. Pendant notre investigation, nous avons détecté une surcharge structurelle de la ME des protéines qui amène à sa déstabilisation et déclenche des mécanismes régulateurs. Ceci nous a mené à explorer la réponse bactérienne de l’expression forcée des TBDRs de la part d’un promoteur fort, des régulations positives massives de pompe à efflux, ainsi que d’autres systèmes saturant l’ME.5 Pour analyser cette réponse au stress de C. crescentus, nous avons utilisé un reporteur de l’expression d’un petit ARN régulateur nommé chvR et donc de son propre réseau régulateur à travers un système à deux composants : le régulateur ChvI et sa kinase ChvG. Finalement, le dernier aspect du projet est basé sur de la littérature qui suggère que la L- alanine et le glucose pourraient être des substrats naturels des TBDRs et utilisés comme source de carbone par les cellules. Nous voulions confirmer si cette spécificité se retrouve sur une seule TBDR ou infirmer qu’un grand nombre de TBDRs peuvent partager des substrats communs. Pour explorer cette idée, nous avons décidé de déterminer le coût du fitness en présence de mon ensemble sélectionné de souches exprimant les TBDRs en milieu minimum avec soit du glucose soit de la L-alanine. En résumé, mon projet caractérise le spectre d’antibiotiques capable de passer au travers de certaines TBDRs, la réponse au stress sous forte charge de protéine dans la ME, et finalement leur(s) potentiel(s) rôle(s) naturel(s). Dewey 616 Dewey 580 Master in molecular biology, genetics, development and evolution (MBDGE) 54 Département de microbiologie et médecine moléculaire 21B 45 Département des sciences végétales 163 false 554 Régulation du cycle cellulaire dans C.crescentus, une bactérie asymétrique 895 6495b96a-021f-48ab-8601-b4e401679be1 Master thesis Restricted Master_report_DAHAN_Virginie.pdf 3402221 application/pdf 0c197532fa082687d41aa099d9df00480dcc846a38505e49e71c179e474e4ecb restrictedAccess Faculté de médecine / Section de médecine fondamentale / Département de microbiologie et médecine moléculaire Faculté des sciences / Section de biologie / Département des sciences végétales

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Transport across the outer membrane and itsregulation in Caulobacter crescentus				2025	16	0

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