Establishment of a FBS- and xeno-free culture system for low numbers of freshly isolated (and transfected) Iris Pigment Epithelial (IPE) and induced Pluripotent Stem cell (iPS)-derived Retinal Pigment Epithelial (RPE) cells

Diplôme Master Establishment of a FBS- and xeno-free culture system for low numbers of freshly isolated (and transfected) Iris Pigment Epithelial (IPE) and induced Pluripotent Stem cell (iPS)-derived Retinal Pigment Epithelial (RPE) cells eng 2022-02-11 author Breuillard Nathan 869799 director Thumann Gabriele 0000-0003-3682-9569 785873 Les systèmes actuels de culture cellulaire in vitro utilisent fréquemment des composants d'origine animale pour soutenir la croissance des cellules. Les cellules épithéliales pigmentaires de l'iris (IPE) prolifèrent in vitro, si elles sont ensemencées en nombre suffisant et cultivées avec du sérum foetal bovin (FBS). Cependant, dans un contexte pré-clinique, un système exempt de composants xénogéniques, issu d’une autre espèce, est fortement recommandé et en outre, le FBS fait l'objet de controverses éthiques et scientifiques majeures. Nous développons une approche de thérapie génique, dans laquelle des cellules IPE autologues seront génétiquement modifiées pour surexprimer le facteur anti-angiogénique dérivé de l'épithélium pigmentaire (PEDF) afin de traiter la dégénérescence maculaire néovasculaire liée à l'âge (nvAMD), une cause majeure de cécité chez les personnes âgées. Pour démontrer à la fois la sécurité et l'efficacité du produit cellulaire, 5 000 à 50 000 cellules IPE doivent être cultivées dans des conditions physiologiques, exempt de produit d’origine animal. Dans ce but, le présent projet visait à établir des conditions de culture sans FBS en utilisant différentes concentration de lysat de plaquettes humaines (hPL) comme alternative pour le maintien d’un faible nombre de cellules IPE humaines et porcines (hIPE, pIPE) fraîchement isolées et cultivées pendant 2 à 4 semaines. Le système de culture a été amélioré par la coculture de pIPE avec des cellules nourricières ARPE-19 dont le cycle cellulaire a été inhibé, l'utilisation de solutions de facteurs de croissance et d'une matrice de support commerciales. Des analyses microscopiques, des marquages et des tests biochimiques ont été réalisés pour évaluer la morphologie et le nombre de cellules, ainsi que leur viabilité. Le projet a permis d'identifier la concentration optimal de hPL à 3% pour la prolifération des cellules IPE, bien que le système de culture reste moins efficace que le système classique à base de FBS. En parallèle, la mise en oeuvre d'un système de culture exempt de composants xénogénique et économique pour les cellules pluripotentes souches induites (iPS) a pu être finalisée avec succès, permettant l'élargissement de l'approche de la thérapie génique à des cellules épithéliales pigmentaires de la rétine (RPE) dérivées de cellules iPS. Current in vitro cell culture systems frequently use animal-derived components to support cell growth. Iris Pigment Epithelial (IPE) cells proliferate in vitro, if seeded in sufficient cell number with Fetal Bovine Serum (FBS) as supplement. However, in the pre-clinical context, a xeno-free system is highly recommended and furthermore, FBS is subject to major ethical and scientific controversies. We are developing a gene therapy approach, in which autologous IPE cells will be genetically modified to overexpress the anti-angiogenic pigment epithelium-derived factor (PEDF) to treat neovascular Age-Related Macular Degeneration (nvAMD), a major cause of blindness in elderly people. To prove both, safety and efficacy of the cell product, 5’000 to 50’000 IPE cells need to be cultured in physiological, xeno-free conditions. For this purpose, the present project aimed to establish FBS-free culture conditions using human Platelet Lysate (hPL) in different concentrations as medium supplement alternative for low numbers of freshly isolated human and porcine IPE (hIPE, pIPE) cells cultured for 2 to 4 weeks. The culture system was additionally enhanced by the co-culture of pIPE with mitotically arrested ARPE-19 feeder cells, the use of commercial growth factors, and a commercially available matrix. Microscopical analyses, staining and biochemical assays were performed to assess cell morphology, cell number and viability. The project could identify the best hPL concentration of 3% for IPE cell proliferation, though the culture system remained less efficient than the classical FBS-based system. The secondly performed implementation of a xeno-free and economic culture system for iPS cells could be successfully finalized allowing the broadening of the gene therapy approach to iPS-derived RPE cells. Dewey 616.8 Dewey 590 44 Département de génétique et évolution 162 61 Département des neurosciences cliniques 226 false 582 Ophtalmologie expérimentale 925 581ce961-b548-496c-9380-87b1405525fd Master thesis Restricted 20220211_Msc_NB.pdf 2993685 application/pdf restrictedAccess Faculté des sciences / Section de biologie / Département de génétique et évolution Faculté de médecine / Section de médecine clinique / Département des neurosciences cliniques

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Establishment of a FBS- and xeno-free culture system for low numbers of freshly isolated (and transfected) Iris Pigment Epithelial (IPE) and induced Pluripotent Stem cell (iPS)-derived Retinal Pigment Epithelial (RPE) cells				2022	101	16

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