L'analyse de composés pharmaceutiques dans les matrices biologiques par LC-API-MS nécessite une préparation d'échantillon préalablement à son injection dans le système. Ce travail de thèse s'est d'abord intéressé à l'amélioration du développement de la préparation d'échantillon. Un moyen de simplifier et accélérer ce dernier a tout d'abord été présenté. Les effets matrice rencontrés lors de l'analyse de fluides biologiques en LC-MS a également été étudié, en particulier lors de l'utilisation de la photo-ionisation à pression atmosphérique (APPI). Une revue a été consacrée à cette dernière pour le couplage LC-MS. La qualité de préparation en ligne d'échantillons plasmiques a également été testée avec divers supports, en termes d'effets matrice générés sur les trois sources commercialisées (ESI, APCI, APPI). Une étude sur la caractéristation et la classification des effets matrices a ensuite été menée. Finalement, la validation d'une méthode pour l'analyse de benzodiazépines dans le sang total a été décrite en LC-APPI-MS.